2.3.3. Биохимические средства защиты растений от грибов

Выделяются две большие группы веществ, обеспечивающих устойчивость данного вида растения к патогенным грибам (Ingham, 1973; Wood, 1982; и др.]. Одна группа веществ постоянно присутствует в высшем растении, независимо от того, произошла атака гриба на него или нет. Эти вещества называют преинфекционнымн соединениями.

Другая группа веществ отсутствует в здоровом и неатакованном растении, но появляется в нем после инфекции гриба. Эти вещества носят название постинфекционных соединений.

Преинфекционные соединения. Среди них выделяют две группы веществ. Во-первых, прогибитины - постоянно предсуществующие в растении метаболиты, которые уже в имеющейся концентрации уменьшают или полностью останавливают развитие патогена in vivo. Во-вторых, так называемые ингибитины - метаболиты, концентрация которых в тканях растения после инфекции резко увеличивается.

Экологически важно следующее. Роль многих из преинфекционных соединений выходит за рамки индивидуальной устойчивости данного организма к патогену. Многие преинфекционные соединения защищают растения не только от грибов, но и несут другие экологические функции: участвуют в аллелопатическом подавлении других растений или в какой-то мере уменьшают пищевую активность растительноядных животных.

Прогибитины. Многие из них - вещества фенольной природы, но есть и другие вещества (среди тех нрогибитинов, структура которых установлена). Примерами таких прогибитинов могут служить протокатеховая кислота и катехол, оба вещества из лука Allium сера. Другой приме - пиносильвин (pinosylvin) из древесины сосны (оксистильбен с двумя оксигруппами). В люпине найдены лутеон (lnteone) и 2 -деоксилутеон, в проростках ячменя (Hordeum) - гордатин A (hordetine А) и гордатин Б, в овсе (Avena) - авенацин (avenacin), в корнях магонии (Mahonia trifoliate, сем. барбарисовых) - берберин (berberine).

На примере биохимических взаимодействий овса и гриба аско- мицета офиоболюса - Ophiobolus graminis, вызывающего корневую гниль у злаков, можно наблюдать, как на биохимическом уровне происходит эволюционная притирка вида-продуцента и вида-кон- сумента. У данного гриба, как и у многих других патогенов, описано несколько разновидностей, отличающихся специализацией на определенных видах-хозяевах. Одна из разновидностей О. graminis var. avenae специализируется на овсе; эта разновидность при своей совместной с овсом эволюции выработала фермент авенациназу, гидролизующий связь, которой к авенацину присоединяется терминальный остаток пентозы. После его отщепления авенацин теряет токсичность. Аналогичным образом (но при широком наборе биохимических механизмов) происходит эволюционная выработка резистентности членистоногих и растений к ядохимикатам.

Таблица 5. Примеры токсичных для грибов веществ, локализованных на поверхности растений [Harborne, 1983]

Сходная ситуация обнаружена при биохимическом взаимодействии овса с грибом дрехслерой - Drechslera avenacea. У овса есть ингибитор авенакозид А. Есть указания на то, что дрехслера выработала фермент, отщепляющий остаток глюкозы от 26-го углеродного атома (С26) авенакозида А.

Среди тюксичных для грибов веществ выделяют группу веществ, локализованных на поверхности растений и составляющих один из первых эшелонов обороны от грибов (табл. 5).

Ежегодно описывают новые вещества растений с антифунгальным действием. Примеры некоторых новых данных в этой области приведены в табл. 6.

Ингибитины. После инфекции патогена у многих растений около места инфекции возрастает концентрация некоторых ароматических соединений. Сравнительно хорошо изучено накопление производных кумарина и кумаровой кислоты. Последняя получается из тирозина после отщепления аминогруппы и образования двойной связи.

Таблица 6. Некоторые антифунгальные вещества высших растений

Так, при взаимодействии картофеля и гриба фитофторы - Phytophtora infestans (класс оомицетов) вблизи места инфекции картофельных клубней спорами фитофторы может резко увеличиваться концентрация кумарина скополетина (в 10-20 раз), а также хлорогеновой кислоты (в 2-3 раза).

Постинфекционные соединения. Среди них выделяют две группы веществ. Во-первых, постингибитины - вещества, образующиеся при модификации (гидролизе или окислении) предсуществовавших в растении нетоксичных веществ. Во-вторых, фитоалексины - метаболиты, которые образуются после инфекции растения совершенно заново, как полагают, в результате активизации генов или активации латентной ферментной системы.

Постингибитины. Принцип ввода в действие токсичных веществ путем модификации ранее накопленных нетоксичных предшественников очень широко распространен в биохимической экологии. Он используется не только при защите растений от атак патогенов (табл. 7). Этот же принцип реализуется и при обороне растений от фитофагов, и при аллелопатических взаимодействиях между растениями.

Таблица 7. Примеры некоторых фунгитоксинов, присутствующих в растениях в связанной форме bound toxins) [Harborne, 1983]

Экологически интересно, что, по-видимому, хотя бы в некоторых случаях широко используется не только принцип, но и класс веществ - полифункциональные конкретные вещества. Это может относиться к цианогенным гликозидам, которые служат для защиты и от патогенных микроорганизмов, и от животных-фитофагов.

1. Цианогенные гликозиды. Интересно биохимическое взаимодействие лядвенца Lotus corniculatus (сем. бобовые) и патогенного гриба стемфилиума - Stemphylium loti. Лядвенец накапливает цианогенный гликозид - линамарин. Под действием фермента ли- намариназы от него отщепляется остаток глюкозы. Получившееся соединение спонтанно распадается с образованием HCN. Однако патоген экологически связан с лядвенцем (латинское название гриба не случайно). Это означает, что патоген способен преодолевать химическую оборону лядвенца; в ходе коэволюции с данным растением он выработал фермент формамидгидролиазу, который превращает HCN в формамид.

Известны и многие другие цианогенные гликозиды. Так, у растений рода брассика (Brassica), куда входят капуста, брюква, репа и турнепс, образуется содержащий глюкозу синигрин. Под действием фермента мирозиназы он образует изородановый аллил (аллилгорчичное масло) СН₂=СН-СН₂-NCS.

Еще одна экологически интересная группа примеров - виды Рода тюльпан (Tulipa) из сем. лилейных. Растения этого семейства образуют луковицы, в которых накапливаются и длительно хранятся питательные вещества. Луковицы локализованы в почве, где могут подвергаться атаке грибов. Тем не менее луковицы не поражаются или сравнительно мало поражаются грибами благодари наличию ряда адаптаций, в том числе фунгитоксичных веществ.

Например, у тюльпанов описаны гликозиды 1-тулипозид A (tuli- poside А) и 1-тулипозид Б. Они могут превращаться в тулипалин A (tulipalin А) и Б соответственно. Оба последних соединения высокотоксичны для грибов.

Еще одна группа соединений, которые могут выступать и в роли постингибитинов, и в роли других экологических хемоэффекторов или хемомедиаторов,- фенолы.

2. Фенолы. Один из путей резкого увеличения их токсичности - окисление предсуществующих 3,4-оксифенолов с образованием высокотоксичных о-хинонов, которые могут конденсироваться с аминосоединениями с образованием еще более токсичных соединений. Именно таково защитное вещество - постингибитин яблони, являющееся производными 3-оксифлоретина (3-hydroxyphloretin).

Образование фунгитоксичного о-хинона из фенола происходит благодаря ферменту (фенолазе), который вступает в действие лишь после того, как заражающий патоген нарушает клеточные мембраны.

Рассмотрим вторую крупную группу постинфекционных соединений [Метлицкий, Озерецковская, 1973; Bailey, Mansfield, 1982; и др.].

Фитоалексины. Постулат о существовании веществ типа фитоалексинов, образующихся в растении после инфекции, выдвинули в 1941 г. Мюллер и Бёргер (Muller, Borger). Первый фитоалексии был выделен, кристаллизован и химически охарактеризован лишь в 1960 г. Круикшенком и Перрином (Gruickshank, Perrin). Этим фитоалексином оказалось вещество из группы птеро- карпанов, обнаруженное в горохе (Pisum sativum) и названное поэтому пизатином (pisatin). Пизатин образуется в горохе после заражения его грибом монилиния - Monilinia fructicola (подкласс эуаскомицеты).

К началу 80-х годов было изучено химическое строение более 50 фитоалексинов (см., например, [Дьяков, 1983]).

По своей химической структуре фитоалексины очень разнообразны [Метлицкий, Озерецковская, 1973]. Среди них находят изофлавоноиды (сем. маревые и бобовые), полиацетилены (сем. сложноцветные), терпены, терпеноиды и их производные (сем. молочайные, вьюнковые, мальвовые, пасленовые), производные фенантрена (сем. орхидные), бензойные кислоты (сем. розоцветные), изокумарины (сем. зонтичные) и др. [Дьяков, 1983].

Ежегодно сообщается об идентификации в инфицированных грибами растениях все новых антифунгальных соединений.

Один из примеров - выявления в корнях Vigna angularis ("adzuki bean") после инфекции растений авирулетным штаммом Cephalosporium gregatum тип В (другой, ранее известный патогенный штамм обозначен как тип А) девяти антифунгальных веществ, среди которых новый изофлаванон дигидроуайтеон [Abe et al., 1987].

Общая черта многих различных по химической структуре фитоалексинов - некоторая степень липидорастворимости (гидрофобности). Даже у фенольных соединений нередко ряд полярных гидроксильных групп маскирован метилированием или образованием метилендиоксильных колец. Это может указывать на то, что фитоалексины способны взаимодействовать с клеточными мембранами грибов.

Имеются свидетельства, что первичное действие некоторых фитоалексинов на клетки-мишени - подтверждение мембран последних: вызываемые различными фитоалексинами лизис зооспор грибов и эритроцитов, быстрая деполяризация мембранного потенциала харовых водорослей, потеря электролитов, обесцвечивание дисков сахарной свеклы и т. д. (например, [Дьяков, 1983]).

Синтез фитоалексинов в клетках растений активизируется под действием некоторых химических веществ - так называемых элиситоров (elicitors), изучению которых посвящена немалая литература (см., например, [Дьяков, 1983; Проценко, 1987]).

Элиситорная активность показана для широкого круга веществ, в том числе для таких, как различные углеводы (например, глюкоманнаны, β-1,3-глюкан, гепта-β-глюкозид), гликопротеины, липиды. Найдено элиситорное действие липогликопротеинового комплекса и некоторых жирных кислот - эйкозапентеновой и арахидоновой, выделенных из клеток фитофторы - Phytophthora infestans (например, [Дьяков, 1983; Проценко, 1987]). Интересно, что свойствами элиситоров обладают и некоторые синтетические вещества, а также такие факторы, как соли тяжелых металлов, Уф-облучение, ряд пестицидов и детергентов.

Весьма интересным классом веществ грибов, участвующих в биохимическом диалоге грибов и растений-хозяев, являются так называемые супрессоры-метаболиты, способные ингибировать реакцию образования фитоалексинов у сортов растения-хозяина, совместимых с данной расой гриба (см., например, [Проценко, 1987]).

По-видимому, экологические отношения растений и грибов подвергались весьма сложной эволюции на молекулярном уровне: растения эволюционно вырабатывали более активные фитоалексины и способность диагносцировать факт начала инфекции, а грибы - более эффективные биохимические механизмы защиты от фитоалексинов (то же самое может обобщить на всю группу химических защитных средств у растений).

Для изофлавоноидов, например, установлено два типа биохимических механизмов их инактивации: гидроксилирование ядра и деметилирование метоксильных групп. Можно отметить, что оба типа этих реакций уменьшают липорастворимость. Продукты этих реакций более подвержены окислительному разрыву ароматических колец. Примером может служить детоксикация медикарпина из Донника (Melilotus). Гидроксилирование его ядра приводит к уменьшению биологической активности; дополнительное, второе, гидроксилирование приводит к полностью неактивному веществу. Обе эти реакции описаны под действием некоторых грибов. Изучение биотрансформации и детоксикации фитоалексинов имеет широкое биотехнологическое значение; эти реакции важны для изучения более широкого вопроса о путях биотрансформации и инактивации живыми организмами ксенобиотиков (в том числе загрязняющих среду их обитания, см. гл. 6), а также способов биотехнологического синтеза некоторых органических соединений.

Биохимический диалог между грибами и растениями пока еще недостаточно изучен; он далеко не исчерпывается изложенным выше.

Так, некоторые грибы способны вырабатывать белки, которые связывают и тем самым инактивируют молекулы, служащие химической защитой растений. Возбудитель антракноза злаков Соlletotrichum graminicola (Ces) Wils. вырабатывает гликопротеины, способные связывать фенолы, которые образуются растениями в ответ на инфекцию. Эти гликопротеины являются одним из основных компонентов слизи, покрывающей споры грибов данного вида [Nicholson et al., 1986].

Новые данные о различных веществах растений, токсичных для грибов и подавляющих их развитие, размножение, прорастание спор и другие процессы, приведены в работах различных авторов (например, [Анисимов, 1987; Гродзинский и др., 1987; Bailey, 1986].

Другие способы и аспекты биохимической защиты высших растений от патогенов. Помимо перечисленных соединений, обладающих в той или иной степени фунгитоксичным действием, необходимо отметить еще некоторые факты, важные для биохимической защиты растений от патогенов.

Растения во многих случаях способны подавлять те ферменты, которые служат авангардом в атаке гриба,- ферменты, расщепляющие компоненты клеточных стенок у растений.

Кроме токсинов, ингибиторов и ферментов, немалую роль могут играть и органические кислоты. Их значение обусловлено тем, что токсичность многих вторичных метаболитов для грибов зависит от pH и максимальная их токсичность проявляется лишь при определенных значениях pH. Органические кислоты участвуют в детерминировании величины pH и могут сдвигать ее в область, где токсичность метаболитов грибов понижена.

Еще один способ защиты растений - инактивация токсинов грибов. Растения могут в определенных случаях модифицировать молекулу токсина и образовывать конъюгаты их с молекулами своих клеток (интересно, что последний способ защиты подобен некоторым путям детоксикации загрязняющих веществ, см. гл. 6).

Есть основания предполагать, что в защите растений могут участвовать механизмы, связанные с генерацией активных форм кислорода (см., например, [Аверьянов, Лапикова, 1988, 1989]).

Экологическая роль защитных веществ растений. Вещества, тормозящие развитие грибов, фактически выступают регуляторами на участке важного раздвоения потока энергии через экосистему, а именно на участке, где происходит разделение энергетического потока на пастбищную и на детритную трофическую цепь. Та часть растительной биомассы, которая окажется доступной для грибов и усвоенной или не кротизированной ими, идет по детритной трофической цепи. Та же часть, которая окажется недоступной (в значительной мере благодаря химическим защитным средствам растений) для грибов, наоборот, становится потенциальным энергетическим ресурсом для растительноядных животных и может использоваться далее по пастбищной трофической цепи. Тем самым биохимические средства защиты растений, как и биохимические средства атаки у грибов, приобретают функцию экологических хеморегуляторов, а в какой-то мере и ценозорегуляторов.

Практическое значение защитных веществ растений для экологизации сельского хозяйства. Для экологизации сельского хозяйства и уменьшения использования пестицидов, в том числе фунгицидов, перспективным направлением является выведение таких сортов растений, которые от природы устойчивы к патогенам. Немалую роль в этой устойчивости играют отмеченные классы веществ. Выведение сортов растений, наиболее богатых пре- и постинфекционными антифунгальными соединениями, в свою очередь, предполагает хорошую изученность этих веществ и закономерностей их распределения у растений.

Некоторые из них, возможно, удастся применять в сельском хозяйстве как экологически безопасные и специфичные к определенным патогенам фунгициды. В пользу такой возможности говорит следующее. Фитоалексин перца - сесквитерпеноид капсидиол (capsidiol) был использован в борьбе с фитофторой на томате в виде раствора с концентрацией 5 × 10^-4 М (Ward et al., 1975; см. [Harborne, 1982]).

Еще один возможный подход - обработка растений элиситорами фитоалексинов. Она может проводиться различными препаратами: слабо вирулентными штаммами грибов, средой прорастания спор грибов, препаратами клеточных стенок и глюканами из грибов, а также некоторыми искусственными соединениями. В результате индуцируется устойчивость растений благодаря росту их фунгитоксичности. Однако обработка элиситорами имеет и свои недостатки. Многие из веществ с элиситорным действием фитотоксичны. На синтез фитоалексинов растения расходуют много энергии и в отсутствие эпифитотии обработка элиситорами вызывает снижение урожая [Дьяков, 1983]. Токсичные фитоалексины могут снижать кормовые и пищевые качества растений.

Среди новых и перспективных путей использования веществ, которые участвуют во взаимодействиях растений и поражающих их грибов-патогенов,-применение так называемых сенсибилизаторов. Сенсибилизаторами называют природные и искусственно синтезированные вещества, усиливающие образование в растениях фитоалексинов в ответ на заражение.

Так, из клеток фитофторы - Phytophthora infestans выделено вещество (липогликопротеиновый комплекс), которое повышало Устойчивость картофеля к заражению несколькими грибами - фитофторозом, ризоктониозом, паршой и альтернариозом (Метлицкий,

Озерецковская, 1981; Метлицкий и др., 1978; см. [Дьяков, 1983]). О высокой эффективности действия этого вещества говорит то, что однократная обработка им действовала так же успешно, как четыре опрыскивания фунгицидом цинебом.

Для практики имеет немалое значение то, что сенсибилизаторы обладают длительным действием. Так, обработка клубней картофеля перед посадкой упомянутым веществом из фитофторы влияет на образование фитоалексинов в зараженных клубнях картофеля нового урожая.

Сенсибилизирующим воздействием на растения обладают и некоторые искусственные соединения. Так, производное 2,2-дихлор-3, 3-диметилциклопропана способно повышать образование рисом защитных веществ (момилактонов) в ответ на заражение некоторыми патогенами. Небезынтересно, что сенсибилизирующее воздействие могут оказать и некоторые гербициды и фунгициды.

Использование и активация природных биохимических механизмов защиты растений от патогенных грибов, возможно, позволит снизить применение пестицидов в сельском хозяйстве и благодаря этому уменьшить загрязнение экосистем этими важными поллютантами.

Однако анализ последних данных указывает на то, что молекулярный диалог, инициирующий биохимическую войну между инфицирующим растение грибом и растением-хозяином, является весьма сложным многостадийным процессом. Биохимическая защита растений от грибной инфекции - гораздо более сложное и динамичное явление, чем полагали ранее. Более глубокое познание эколого-биохимических проблем, порождаемых современным уровнем знания и незнания в этой области, - необходимое условие выработки практических приемов борьбы с инфекцией патогенных грибов. Вместе с тем становится ясно, что применение фунгицидов - явно слишком грубая и несовершенная имитация одной из заключительных стадий химической борьбы растений против патогенных грибов.